月: 2008年3月

自分のポスター。わりと評判よかったです。
– IS とか transposon とか探せるかな? (transposon in transposon とか、泣きそう)
– contig を並べ直すときに近縁種と並べて使えないかな?
– ortholog 探すのに使える?
– draft sequence を読んだあとに速攻で使いたいぜ、というのが多いな。近縁種ゲノムに貼り付けるツールはあるはずなんだけど。
奈良女子大の佐伯先生が、さりげなくポスターで紹介してくださいました。


無重力状態ではバイオフィルムとかがどうなるのか、という研究。宇宙飛行士の健康とかを考えるとかなり重要だと思うのだが、アメリカなんかではそういう情報がけっこう機密扱いらしく、日本は日本でやらなきゃいけないのか。

GenomeMatcher. いろいろかわいい表示が出ます。負けてられません。

[ 実用菌株を中心とした麹菌のゲノム進化の解析と醸造特性との関連について ]
Aspergillus は基本的に glucose と無機塩類があれば育つので、米麦大豆などとの共進化、みたいなのは特にないらしい。ゲノムは数 % の違い。
実際に、清酒と醤油を同じ菌でつくることもできるらしい。
でも、清酒と醤油では培地が違うし、自然に歴史のなかで用途によって適したものが使い分けられてきている、ということらしい。
毒素とかは 2/3 の株遺伝子群がで欠落しており、持っているものでも発現はしていない。
[ ゲノム解析に基づいた清酒酵母の醸造特性の解析 ]
清酒の香り成分などは酵母 (S. cerevisiae に似ている) によって作られる。
S. cerevisiae は一倍体だが、清酒酵母は通常二倍体 (一倍体でも増殖する) 。
低温でよく増殖する、生成酒の香味が優れている、諸味で高泡を形成する、ビオチン非要求性、などが特徴。

協会7号酵母のゲノムはほぼアセンブルが終わっている。実験室酵母とほぼ同じだが、いくつかの染色体で小さな逆位があったりする。

清酒酵母に特異的な遺伝子 (高泡を形成する遺伝子は AWA1 だ!) の多くは、染色体の両端に存在する。
実験室酵母にあって清酒酵母にない遺伝子やその逆は数えるほどしかない。
ビオチンを作る遺伝子 bio6 と bio1 がクラスタを形成し、4つの染色体の末端に存在。清酒・焼酎酵母だけがこれらを持っていて、ビオチンを合成する。



産業上重要な遺伝的形質の多くは量的形質。エタノール生産性とかね。これに関わる遺伝子座を調べるのが QTL analysis.
清酒酵母・実験室酵母それぞれ一倍体を交雑してヘテロ二倍体を作り、それで胞子分離一倍体を得る。これで醸造を行い、DNA マーカーで各種遺伝子の由来 (実験室酵母か醸造酵母か) を調べながら量的形質との関連を探る。






QTL 解析の結果、実験室酵母のほうが醸造酵母よりも生産性が高い物質もある → 改良の余地があることがわかる。
実験室酵母はずっとみんなが増やしているので、実際に飼っているものとの配列の違いが問題に問題になったりしない？ → 遺伝子があるとかないとか、そういう大きな違いのところから始めているので問題ない。
[ 下面発酵酵母の減数分裂分離体を用いたQTL解析 ]
下面発酵酵母は S. cerevisiae ではなく、S. pastorianus.
ワイン酵母系の染色体と cerevisiae 系の染色体を両方もっているが、それらが交雑してしまうことはない。
完全長ゲノムはまだない。ビール大手3社がそれぞれドラフト配列を持っている状態。

QTL 解析をするには遺伝子マーカーを使うが、マーカーの数を増やせば解像度が上がる、というものではない。というのは、交配によってすべてのマーカー間の依存関係を完全に断ち切れるだけの個体を用意しなければならないから。ただ、死んじゃう胞子がけっこうあったりする上に、それをひとつひとつ genotype して発酵試験もしなければいけないので、とても大変。

実験の話が中心でよくわかりませんでした。すいません、、、
[ 地下生命圏におけるメタゲノム解析 ]
ODP: Ocean Drilling Program の掘削コア堆積物中に 1cc あたり 100,000 を超える！
地下生命圏は質量にして地球上の生命圏の 90% を占めるが、海底以下 100m をこえるとほとんどは死んでいたりする、静かな世界。
でも、プレート境界域とか、油田ガス田鉱山といった、水やエネルギーの流れのある場所ではそれに依存した活動的な生態系が生じる。
活動的地下生命圏は条件に依存した、わりと多様性の低い環境。それに対して、海底は非常に複雑。

菱刈金山:
30% が Archaea。16S rRNA の多様性は極めて低い。
末端配列から Bacteria / Archaea の判別がだいたいできることがわかったので、全ゲノム解析中。
ひとつの Archaea (HWCG I) についてはほぼ全長 (1.7M) が決まっている。
冷湧水域堆積物中における嫌気的メタン酸化群集の解析:
メタンハイドレートなど由来の高濃度メタンを含む海水で生きている連中。
メタン生成に関する遺伝子のほとんどすべてがメタゲノムライブラリから検出され、メタン酸化をメタン生成菌の逆反応でやっていることがわかった。すごいなー。
鉱山酸性排水バイオマット:
MS を使った初めてのコミュニティプロテオミクス。
微生物多様性の高い海底下生命圏への挑戦:
16S しかわからないやつとか、山のようにいる。


複雑さとしては、土壌 ＞ 海底 ＞ 腸内 ＞ sargasso sea.
メタゲノムの問題は、基本的に数が多いやつのゲノムだけが見えちゃって「重要だけど少ない」連中のゲノムをとってくるにはものすごくお金がかかること。
これをなんとかしていくには single cell genomics が必要。培養しなくていいしね。
いい菌をとってきた、と思っても single cell genomics な時代だと、もう誰かが読んじゃっておいしいところをもっていかれているかも。これからは地球化学や微生物生態学と、いまゲノムとか応用微生物学をやってるひとが仲良くしないと欧米に勝てないぞ！
[ Lactobacillus brevis KB290のゲノム解析、および抗生物質耐性試験 ]
KB290: 京都の漬物「すぐき」から分離した。
すぐれた耐酸性があり、腸内への到達性が高い。
安全性評価のためにゲノムを解読。109 contigs, 2.4Mbp.
病原因子がないか (日和見感染とかがないか)?
– no virulence gene at cutoff of 10^-10
– 安全性調査のためのデータベース: MvirDB
薬剤耐性がないか (他の菌にうつるおそれがあるので)?
– 欧州にはそういうガイドラインがある
– vancomycin, tetracycline, ciprofloxacin への耐性がガイドラインの数倍。でも、本当にヤバい菌は基準値の 100 倍とかになるらしい!!
– 基準値を超えているので、接合伝達試験をして、他の菌に移るかどうかを試す。相手は E. feaecalis FA2-2 (腸球菌かな?) 問題なかった。
– 既知の耐性遺伝子が存在しないことも確認した。欧州の基準ではその他の耐性遺伝子がないことを確認することも求めており、それもクリア。
– point mutation でものすごく耐性がでることがあるので、そういうのもチェック。
など。とりあえず安全そう。テストって大変だなー。みんなやってるの？？

マウスや人でのテストも問題なし。というか、既にみんな食べているやつなわけで。
腸管への付着性も評価。
腸管付着因子として知られているタンパク質がどれくらいあるかを調べたが、
残念ながら実験の結果も検索の結果も、あまり高くない。
ゲノムでテストをしたほうがコストとかのメリットがある? → もともと食べられていたものなので、最初にマウスとかでやる必要はなかった。ゲノムによる情報も実験と同じくらい重要で効果的であると考えている。動物実験は外部に委託するので、数千万円というお金がかかり、ゲノム解析の方が安い部分もある。
Lactobacillus の病原性としてはどのようなものが考えられる? → DB にあるのは薬剤耐性の translocation。
Translocation は host が病的な状態であるときに問題になることがあり、動物実験をしないといけない部分がある。

応用ゲノム。
[ 38: 塩類集積環境の重金属浄化に有用なセルフクローニング型アーミング Halomonas elongataの作製 ]
塩性化・アルカリ化・重金属の濃縮などが同時に起こる場合の浄化。
H. elongata は金属結合ドメインをもっており、それを外膜リポタンパク質にくっつけることで、細胞表層に呈示するようにする。
外来遺伝子を導入せずに、相同組み替えだけで実現。
1. 高塩濃度条件 (3% NaCl, 18% NaCl) で安定して機能する外膜リポタンパクの選定。
2. 高発現させたときに細胞が凝集しないものをえらぶ
3. そのリポタンパクが欠失しても (これから機能を変えちゃうので) 塩ストレスで死滅したりしないかを確認
Cu 選択的な浄化能を示すものができた。
ドメインを多重化することで、さらにパワーアップ！
[ 39: 枯草菌ゲノム縮小株のトランスクリプトーム解析 ]
枯草菌の高いタンパク質分泌能力と、容易な操作性は工業用途にも便利。
だけど、ストレス反応みたいな、いらない機能もあるわけで、それらを削除することで、物質生産に特化したものをつくりたい。
先行研究で、7.7kbp の外来性遺伝子領域を削除したり、必須遺伝子を同定した研究はあるが、生産性向上に寄与したかどうかの評価はない。

874kbp を削除し、セルラーゼ・プロテアーゼの活性を 200% 向上させることに成功。増殖は若干遅いが、定常期においても高い生産性を維持している。
胞子形成に至るシグマ因子の発現は遅れている？


削減株が培養後期でも活発ということは、後期での viability が低下することにならない? → CO2 排出量が減っていないんで、よさそう。
成長をとめて増殖の準備をしようとするところがなくなる、と思うのですが → 後期の細胞の維持もちゃんとやっていそう。溶菌に関するところは削除されている。
セルラーゼ・プロテアーゼ以外の生産性向上については? → 分泌が律速になってあがらないもの (アミラーゼなど) があることもあるが、そこをいじってやれば何とかなると思う。
[ 40: DNAマイクロアレイデータ解析に基づいたエタノールストレス耐性を示す酵母菌株の創製 ]
実験室酵母と、ストレス耐性を有する醸造酵母(協会7号: IFO2347) の違いは？
ストレス耐性遺伝子の発現はエタノール添加前後で違う？

ストレス耐性遺伝子は、なにもない状態でも醸造酵母のほうがたくさん発現している。
実験室酵母でも、tryptophan の取り込みに関わる遺伝子と、培地への tryptophan 添加でエタノール耐性が出る。
実験室酵母が1倍体で協会7号が2倍体なのはどうかと・・・→ すみません、いろいろありまして。
そうか、酵母菌って2倍体もいるのよね。たいへんだ。
[ 41: 乳酸耐性酵母の分子育種工学　-欠失により乳酸感受性を付与する出芽酵母遺伝子の網羅的同定と機能解析- ]
ポリ乳酸がプラスチックとして注目されており、その原料の乳酸を生産させるのに出芽酵母が注目されている。乳酸耐性をうまくもたせることができれば、中和処理なしで大量生産ができるようになる!


乳酸耐性には液胞や細胞内輸送に関係する遺伝子が重要。
– 破壊でも乳酸耐性を引き起こすことができる
– 多コピーで乳酸耐性を得ることもできる。ストレス応答などの遺伝子をプラスミドにいれて overexpression することで乳酸耐性化。安定して動かすために、染色体上で高発現プロモーターとくっつけて成功。
[ 42: カンジダ酵母における病原性ゲノム機能学（網羅的遺伝子発現制御株の構築と応用） ]
S. Ce の必須遺伝子群との ortholog をもとに、必須遺伝子群を同定。800-1000遺伝子くらい？
Tet 株を使っている。マウスに感染させたあとで、飲み水で発現を制御できるので便利。
これをもとに高真菌薬をつくりたい。必須遺伝子群のなかで、ヒトには存在しないものを標的にすることで薬効が高く、副作用の少ないものを狙う。病原真菌に高く保存されている遺伝子に絞り込むことで広い範囲に効くようにもしたい。
5,300 genes / 150 screened in silico / 10 genes in vitro 。実験頑張ってます。ほんとは10個じゃなくて、もうすこしやりたいですが・・・
抗真菌ペプチド医薬。ペプチドを環状化することで安定化させたい。インシリコで分子進化させたものをいくつか実際につくって、テストしている。
[ 43: 醤油乳酸菌Tetragenococcus halophilus NBRC 12172株のゲノム解析 ]
IS が多くて、他の乳酸菌と比べるとゲノム構造はあまり保存されていない。
でも、COG 分類を眺めると、遺伝子は大差ないことがわかる。
TCA サイクルは一部が欠けている、アミノ酸合成系の一部が欠けている、といった特徴。これはほかの乳酸菌とかわらない。
大事なのは塩耐性。
Choline → Glycine betaine の合成系や Na / K の排出 / 取り込み機構 が重要な重要っぽい。
Na 輸送に際して ATP を作れる! これも塩耐性に貢献しているはず。
ほかの耐塩性乳酸菌とはくらべた？ → ほかのゲノムが公開されたばかりなので、まだ比べていない。

万博公園の競技場でサッカーの試合があるらしく、土曜でバスが激しく遅れて最初の4件は聞けず。
[ 36: シアノバチルスにおけるRNAマッピング ]
西田先生 (板谷先生チーム)。Mega cloning で枯草菌に Synechocystis のゲノムをいれたやつ。
発現をみるために、枯草菌＋ラン藻なタイリングアレイを作成。ラン藻のほうが発現が高い。


しかし、枯草菌のゲノムはちゃんと sense 側が転写されており、antisense はあまり転写されていない
が、ラン藻ゲノムは両方とも同じくらい転写されている。どうやら、ラン藻のほうは方向が定まっていない上に、RNA polymerase による elongation がうまくいっていない模様。


枯草菌 sigB が強烈なストレスを感じていろんなのがズガーっと発現している。
外来性遺伝子にタンパク質がくっついて抑制する、ということがない場合もあり、そういう場合は SigB などはラン藻ゲノムのほうにも影響しているよ。
シアノバチルスではラン藻の sigD も発現している。でも、elongation には効いていないみたい。
何を変えると伸張したり停まったり、ということをこれから調べていきたい。いまのところ、うまく伸張しているもののコンセンサス配列や何かは見つかっていない。
ふたつ丸ごとはいっているので、どちらが親だかわからないのですが、なんで「シアノバチルス」なんでしょか。 → バチルスの培地でしか生えないし、光合成もしないので。枯草菌にすこしずつ枯草菌ゲノムの断片を入れていったから？うまくいけばズバッと光合成するようになるかもしれないけど…
[ 37: 細胞性粘菌の比較ゲノム解析による細胞分化起源の解明 ]
細胞性粘菌は飢餓状態に置かれると多細胞化し、胞子細胞と柄細胞に分化する。
しかし、Acytostelium では柄細胞をつくらずに、セルロースのチューブを作って、すべての細胞が胞子になる。
でも、柄細胞をつくるやつのほうが生存戦略としては有利。
D. discoideum はだいたいゲノムが読まれている。36M くらい。
A. subglobosum を読んだ。まだ contig だが、28M くらいになるはず (バクテリアを食べて生きるので、無菌培養系が必要だった)。

Contig を D. discoideum ゲノムにはりつけていくと、ほとんどの遺伝子に対応。ただし、GC% がだいぶ違うので、tblastx によるアミノ酸配列での比較。
柄細胞形成に必要な遺伝子はもともと持っていた模様。発現しているかはこれから調べていく予定。